蛋清溶菌酶的提取及其酶学性质探究(二)
2.1.3 NaCl溶液(洗脱液)浓度优化
由图3可知,蛋清随NaCl浓度的溶菌升高,溶菌酶的酶的酶学比活力先上升后下降,当NaCl浓度为1moL/L时,提取探究所得溶菌酶的性质比活力最高,此时的蛋清洗脱液浓度适宜提取分离溶菌酶。当NaCl浓度高于1moL/L时,溶菌酶的酶的酶学比活力反而下降,酶含量变化却不大,提取探究可能由于溶菌酶在高浓度盐溶液中发生盐析作用导致。性质
2.1.4 洗脱时间优化
由图4可知,蛋清当洗脱时间为60min时,溶菌所得溶菌酶的酶的酶学比活力最高,随着洗脱时间继续延长,提取探究酶含量增加缓慢,性质酶比活力反而下降,综合考虑经济成本,选定洗脱时间为60min。
2.2 阳离子交换法条件优化
综上,由单因素试验结果可知,阳离子交换法最优工艺条件为:蛋清滤液树脂比为10∶2.5,pH9.0,NaCl(洗脱液)浓度1mol/L,洗脱时间60min。由此,进一步做Box-Behnken试验优化阳离子交换法条件,试验设计及结果如表2所示。
采用DesignExpert8.0.6软件进行分析,如表3所示。由表3可知,拟合模型的P=0.0014<0.05,说明模型与实际情况拟合良好。根据以上分析得知溶菌酶比活力R1对自变量每100mL蛋清滤液中树脂用量(A)、NaCl浓度(B)、蛋清滤液pH值(C)、洗脱时间(D)的多元回归方程为:
R1=20866.66-1432.26A+194.18B+486.75C+539.58D-961.62AB-1252.19AC-2929.88AD-21.46BC-2724.86BD+90.11CD-6079.24A2-5995.65B2-3410.58C2-3903.162。
由方程可知,溶菌酶比活力和4个自变量之间具有显著线性关系。回归方程的二次项系数比较大,交互项系数中AD、BD的交互系数很大,说明树脂用量和洗脱时间、NaCl浓度和洗脱时间之间的交互效应很大,AB、AC的交互系数较大,说明树脂用量和NaCl浓度之间、树脂用量和pH值之间交互效应较大,而BC、CD的交互系数比较小,说明NaCl浓度和pH值之间、pH值和洗脱时间之间的交互效应小。
为了检验方程的有效性,对测定的溶菌酶的比活力的数学模型进行方差分析,并对各因子的偏回归系数进行检测。一次项中A的回归系数较显著,P=0.0806,说明蛋清树脂比对提取的溶菌酶比活力有较显著作用。二次项中A、B、C、D的偏回归系数均达到极显著水平。交互项AD、BD回归系数较其它因素显著,说明树脂用量和洗脱时间、NaCl浓度和洗脱时间之间的交互项对溶菌酶比活力影响较为显著。
为了得到最高的溶菌酶比活力,吸附和洗脱的各条件需要合适的交叉选择。响应面图可直观反映各因素及交互作用对酶活力的影响,故取3项显著性较高的交互项制作响应面图,根据图5~7的Box-Behnken优化试验拟合响应曲面图和方差分析得知,对溶菌酶比活力影响大小顺序为AD>BD>AC。
对二次回归方程求一阶偏导,当响应值R1(溶菌酶比活力)为最大值时,各因子水平为每100mL蛋清滤液中,树脂用量(A)为24.20mL、NaCl浓度(B)为1.00mol/L、蛋清滤液pH值(C)为9.10、洗脱时间(D)为62.61min。此时理论预测溶菌酶比活力为21041.1U/mg。
对所获得的阳离子交换法各最优条件做平行验证试验,重复5次,如表4所示,得到的溶菌酶比活力为20509.58U/mg,与理论值接近。
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